摘要：大戟醇（Euphol）是一种存在于大戟属植物中的四环三萜。大戟因其作为一种有潜力的抗癌药物而闻名。令人惊讶的是，尽管大戟醇具有不同的抗肿瘤作用，但直到这项研究发表以来，大戟醇生物合成的相关基因才被鉴定出来。在我们对Euphorbiatirucalli的实验中，地锦草（Euphorbiatirucalli）主要在乳胶中被检测到，这种元素在巴西经常用于癌症治疗。两种特异性表达的氧化奎烯环化酶(OSCs)来自Euphorbiatirucalli，命名为EtOSC5和EtOSC6，通过在羊毛甾醇合酶敲除酵母菌株GIL77中的表达进行功能表征。EtOSC5主要生产大戟醇及其20S异构体，而EtOSC6主要生产蒲公英甾醇和βamyrin。这四种化合物也作为主要的三萜类物质存在于Euphorbiatirucalli中，表明EtOSC5和EtOSC6是形成Euphorbiatirucalli三萜醇的主要催化剂。基于EtOSC5的模型结构和定点突变实验，提出了EtOSC5的活性机制。通过应用最先进的工程技术，EtOSC5的表达与其他三个已知的前体基因一起被染色体整合到酿酒酵母中。所得工程酵母菌株YS5E-1在摇瓶中产生1.84±0.17毫克/升的大戟醇。

杂志名：ACSSyntheticBiology,69,33,–

英文题目：DeNovoBiosynthesisoftheAnticancerCompoundEupholinSaccharomycescerevisiae

作者：WeiboQiao,WeiFeng,LuYang,ChangfuLi,XudongQu,andYanshengZhang

单位：上海大学生命科学学院，中国科学院

图1：大戟属四环三萜的一个亚类，被称为euphane-type胡麻烷型三萜，其晶体结构于年首次阐明。

图2：Euphorbiatirucalli不同组织中的植物化学分析

与胶乳相比，我们定量了大戟醇和替鲁卡醇在替鲁卡利大肠杆菌不同组织中的浓度，包括根、茎和叶，并发现胶乳是积累这两种四环三萜的主要场所。此外，该研究表明，另外两种五环三萜，蒲公英甾醇和β-amyrin也表现出胶乳特异性积累模式。对Euphorbiatirucalli胶乳的转录组分析表明，该胶乳不仅表现为生物流体，而且具有专门转录工厂的功能。因此推测该胶乳可能是转录三萜生物合成基因的关键位点。

图3：对酵母菌株GIL77中表达EtOSC5和EtOSC6产生的产物进行气相色谱-质谱分析

用EtOSC5、EtOSC6和空载体转化的酵母细胞提取物的总离子色谱图。与空载体对照相比，峰1和2是由EtOSC5表达产生的新化学物质，峰3和4是EtOSC6表达的新产品。峰1-4分别被鉴定为大戟醇、替鲁卡醇、β-amyrin和塔拉沙甾醇。这些数据表明，EtOSC5将酵母固有的氧化喹烯转化为大戟醇和替鲁卡醇，而EtOSC6产生塔拉沙甾醇和β-amylin。表明它们是Euphorbiatirucalli胶乳中这些三萜形成的必要催化剂。

图4：在EtOSC5中发现Phe残基对大戟醇的形成很重要

图5：野生型EtOSC5和FY突变体形成的反应产物的气相色谱-质谱分析

图6：大戟生物合成途径整合到酵母基因组中

为了建立遗传稳定的产大戟醇酿酒酵母细胞，应用模块化两步(M2S)染色体整合技术整合酿酒酵母中的大戟醇生物合成途径。为了增加大戟醇产量，包括mva、hSQS和rSE在内的三个前体基因与EtOSC5共表达。这三个前体基因分别在TDH3、ADH1和PGK1启动子的控制下被克隆，并在TEF2启动子的控制下与EtOSC5共同整合到酵母基因组中。当在YPDA培养基中培养时，所产生的菌株YS5E-1显示出与其亲本菌株YS5在时间点上相似的生长模式，这表明大戟科途径的整合对酵母细胞增殖没有或至少几乎没有不利影响。

从酵母提取物的气相色谱图来看，YS5E-1菌株的羊毛甾醇积累量显著增加，而对照YS5菌株的提取物中未发现明显的羊毛甾醇峰，这表明在YS5E-1菌株a中三种前体基因(mva、hSQS和rSE)的组成型共表达促进了氧化奎烯的产生，氧化奎烯又被酵母天然羊毛甾醇合酶转化为羊毛甾醇。

除了羊毛甾醇之外，YS5E-1菌株产生了大量未知化合物(标有星号的峰)，而对照菌株提取物看不到该化合物，通过搜索使用的气相色谱-质谱联用仪附带的本地质谱库，这种未知化合物与9，19-环羊毛甾-24-3-醇显示出约80%的相似性，表明它可能是部分过量羊毛甾醇氧化的结果。YS5E-1菌株显然合成了对照YS5菌株中不存在的大戟醇。大戟醇产量估计为1.84±0.17毫克/升。

结论：

对于非甾体四环三萜，以前只报道了达玛烯二醇-ⅱ及其衍生物的酵母代谢工程。我们注意到，通过其他工程策略，达玛烯二醇-ⅱ衍生物的产量有很大的提高空间，因为在酵母摇瓶条件下可以达到10毫克/升以上。达玛烯二醇的产量远低于羊毛甾醇的产量(3.07-0.37毫克/升)，这意味着这一瓶颈可能在未来通过共同表达一种替代的角鲨烯环氧酶来解决，该酶可以与EtOSC5发生物理相互作用，这种相互作用可能有助于角鲨烯有效地转化为大戟醇。这为以后开发新型抗癌药物具有重大意义。